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荧光定量PCR仪的工作原理

日期:2022-07-01 10:49
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摘要:
  
 
      所谓real-time Q-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
       荧光定量PCR仪反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板初期的含量。为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 (baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义 样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。





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